加样看似简单，实则是ELISA实验中误差的最大来源。一把校准不合格的移液器，可以让你的批内CV从5%飙升到20%。实验前必须检查移液器：吸头匹配、按钮回弹顺畅、定期用重量法校准（200μL吸头取200μL水，称重应在198-202mg之间）。
加样时要贴着孔壁、在液面上方2-3mm处缓慢打出，不要把吸头戳进液体里，更不要打到孔底。加样顺序先加空白孔、标准品低浓度到高浓度，最后加样本，减少交叉污染。每个样本换一次吸头，即使看起来只是重复加样。
加样时间应控制在10分钟以内。第一孔加完到最后一孔加完间隔过久，等于让第一孔提前孵育了十几分钟。这就是为什么96孔板实验建议两人配合：一人加样，一人计时封板。
孵育条件说明书写的"37℃孵育30分钟"，实际温度应使用培养皿内温度计实测。很多二氧化碳培养箱显示37℃，实际孔板位置只有35℃。湿盒也是必需品：干孵育会使边缘孔液体蒸发浓缩，建议在孵育盒底部放湿纱布或加水盒。
洗板环节：每孔加满洗涤液（约350μL），浸泡30秒后拍干，重复4-5次。拍干时在吸水纸上垂直扣拍，不要蹭擦孔底。最后一次拍干后立即加入酶结合物，孔内残留洗涤液会稀释酶浓度。整个流程动作要连贯，不要让板在空气中干燥过久，否则非特异性吸附会暴增。