细胞培养上清是ELISA最常见的样本类型之一。与血清不同，上清基质是培养基，含有酚红、胎牛血清蛋白、抗生素等成分，本身背景较低，但目标细胞因子浓度也低很多，常常接近试剂盒灵敏度下限。
收集时间点要明确。对数生长期细胞因子积累与细胞密度强相关，建议在接种后24h、48h、72h分别取样，绘制时间曲线。取样时不要一次性吸走全部上清，应使用无菌移液器吸出50-100μL，再补加等体积新鲜预热培养基，保持培养体系总体积稳定。
取样后立即4℃、1500×g离心5分钟，去除脱落细胞和细胞碎片。若不立即检测，应分装后-80℃保存。切忌把上清直接放在4℃冰箱过夜，即使4℃，蛋白酶活性仍会缓慢降解IL-1β、TNF-α等不稳定因子。
血清型培养基中，胎牛血清本身含有低浓度牛源细胞因子。如果试剂盒检测抗体不识别牛源，这部分本底可以忽略；但若实验涉及牛种属交叉反应，应设置未刺激的平行孔作为空白对照，扣除培养基本底。
加刺激剂（LPS、PMA、离子霉素）时，要设溶剂对照孔。DMSO终浓度不应超过0.1%，否则会诱导细胞应激释放非特异性因子。记录刺激剂批号、工作浓度、刺激时长，这些信息在论文方法部分缺一不可。