TMB（四甲基联苯胺）是目前ELISA最常用的辣根过氧化物酶底物，显色后呈蓝色，加2M硫酸终止后变为黄色，最大吸收峰从650nm移到450nm。绝大多数ELISA试剂盒说明书指定的检测波长都是450nm。
为什么建议用双波长读数？单波长读450nm时，板底划痕、指纹、液体表面弯月面都会被算进吸光度。参比波长（通常620-630nm）用于扣除这些非特异性吸光度。正规操作是先读450nm，再读630nm，记录OD=OD450-OD630。若仪器只有单波长，可用空白孔调零，但板间差异会被放大。
滤光片带宽也很关键。450nm滤光片带宽建议≤10nm，带宽过宽会把邻近波长的杂光算进来，导致标准曲线斜率偏低。老旧酶标仪若长期未校准，450nm实际峰值可能漂移到460nm，建议每半年用标准吸收片校准一次。
边缘效应（edge effect）是96孔板常见问题：外周孔温度蒸发快，OD值比内圈孔高0.1-0.2。解决办法是外周孔只加洗液做空白，不上样本；或在孵育时在板周围的空孔加入200μLPBS缓冲湿度。
读数时机方面，终止反应后应在10分钟内完成读数，因为黄色产物在强酸条件下仍会缓慢衰减。读板前检查孔内是否有气泡，气泡会使OD虚高。若出现气泡，用打孔的枪头轻触液面或在板底轻轻叩击桌面排出。